Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Pflanzenpathogenen anhand räumlicher und einzelner

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 814 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Pflanzen stehen in Kontakt mit vielfältigen Krankheitserregern und Mikroorganismen. Intensive Untersuchungen in den letzten 30 Jahren haben zur Identifizierung mehrerer Immunrezeptoren in Modell- und Nutzpflanzenarten sowie zu Signalüberlappungen bei oberflächenlokalisierten und intrazellulären Immunrezeptoren geführt. Wissenschaftler haben jedoch immer noch ein begrenztes Verständnis darüber, wie Pflanzen mit räumlicher und zellulärer Auflösung auf verschiedene Krankheitserreger reagieren. Jüngste Fortschritte bei Einzelzell-, Einzelkern- und Raumtechnologien können nun auf Pflanzen-Pathogen-Wechselwirkungen angewendet werden. Hier skizzieren wir den aktuellen Stand dieser Technologien und beleuchten offene biologische Fragen, die in Zukunft angegangen werden können.

Pflanzen können von verschiedenen Krankheitserregern infiziert werden, die Wirtszellen modulieren, um deren Wachstum und Verbreitung zu ermöglichen. Krankheitserreger nutzen vielfältige Manipulationsstrategien, die im Verlauf der Infektion variieren können. Zu diesen Strategien gehören die Unterdrückung der Pflanzenabwehr sowie der Einsatz von Toxinen und abbauenden Enzymen, um die Besiedlung und Nährstofffreisetzung zu erleichtern1. Einige Krankheitserreger können direkt in Pflanzengewebe eindringen und eindringen, während andere durch Wunden oder natürliche Öffnungen eindringen. Durch Vektoren übertragene Krankheitserreger können von verschiedenen Gruppen stechend-saugender Insekten direkt in Gefäßgewebe abgegeben werden. Jeder Mechanismus der Gewebeinvasion bringt den Erreger mit verschiedenen Zell- und Gewebetypen in Kontakt1,2,3.

In einem Blatt werden gleichzeitig verschiedene Krankheitserreger-Infektionsstadien beobachtet4. Die Krankheitserregerverteilung in Pflanzen ist nicht homogen, was zu einer ungleichen Symptomentwicklung führt5,6,7. Die meisten früheren Studien zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Krankheitserregern wurden an ganzen Pflanzen oder komplexen Gewebetypen durchgeführt. Es gibt signifikante Unterschiede zwischen Einzelzell- und Gesamtgewebereaktionen, was darauf hindeutet, dass die auf Gewebeebene beobachtete Reaktion ein Durchschnitt der Schwankungen ist, die zwischen auf Krankheitserreger gerichteten und nicht gezielten Zellen auftreten8. Jüngste technologische Fortschritte ermöglichen es Wissenschaftlern, Pflanzen- und Krankheitserregerreaktionen mit Einzelzellauflösung oder im räumlichen Kontext zu untersuchen9,10,11. Diese Fortschritte werden ein ganzheitlicheres Verständnis der zellulären Reaktionen und der Variabilität innerhalb eines Gewebes ermöglichen.

Pflanzen besitzen ein angeborenes Immunsystem, das aus an der Oberfläche lokalisierten Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) und intrazellulären Nukleotid-bindenden Leucin-reichen Wiederholungsrezeptoren (NLRs) besteht12. PRRs können konservierte mikroben- und schadensassoziierte molekulare Muster (MAMPs bzw. DAMPs) erkennen, was zu einer PRR-ausgelösten Immunität (PTI) führt. Pflanzliche NLR-Immunrezeptoren erkennen sekretierte Krankheitserregereffektoren in Zellen und induzieren eine durch Effektoren ausgelöste Immunität (ETI)12. Obwohl PRRs und NLRs strukturell unterschiedlich sind und verschiedene Pathogenkomponenten erkennen können, weisen sie erhebliche Überschneidungen bei der nachgeschalteten Signalübertragung auf, wie z. B. Kaskaden der mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK), Kalziumfluss, ein Ausbruch reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), transkriptionelle Neuprogrammierung, und Phytohormon-Signalisierung13. Kürzlich wurde gezeigt, dass PTI und ETI sich gegenseitig verstärken, um eine starke Resistenz zu vermitteln14,15. Fortschritte in der Einzelzell- und Raumtechnologie haben das Potenzial, zelluläre Reaktionen in auf Krankheitserreger gerichteten und benachbarten Zellen aufzuklären.

Obwohl die Immunsignalisierung umfassend untersucht wurde, fehlt den Wissenschaftlern immer noch ein Verständnis der räumlichen Expression von Immunrezeptoren in verschiedenen Pflanzengeweben. Viele Jahre lang gingen wir davon aus, dass alle Pflanzenzellen immunkompetent seien. Kürzlich wurde gezeigt, dass nur eine begrenzte Untergruppe der Wurzelzonen von Arabidopsis ohne Schaden direkt auf das Flagellin-MAMP reagiert16,17. Eine detaillierte Charakterisierung reaktionsfähiger Pflanzenzellen während des Infektionsprozesses ist erforderlich, um die Mechanismen zu verstehen, die das Fortschreiten der Krankheit regulieren.

Hier diskutieren wir die Herausforderungen und das Potenzial der Untersuchung von Pathogen-Pflanzen-Interaktionen aus räumlicher und Einzelzellperspektive. Zunächst stellen wir kurz den aktuellen Stand der Raum- und Einzelzellentechnologien vor. Als nächstes beschäftigen wir uns damit, wie diese Technologien zur Lösung offener biologischer Fragen eingesetzt werden können.

Studien auf der Ebene von Geweben oder Organen haben unser Verständnis der Wahrnehmung von Krankheitserregern und der Pflanzensignalisierung bei kompatiblen (anfälligen) und inkompatiblen (Immun- oder Nicht-Wirts-)Interaktionen erweitert12,18,19. Es bleiben jedoch noch viele wichtige Fragen offen. Wie reagieren verschiedene Pflanzenzelltypen auf eine Infektion mit Krankheitserregern? Wie kommunizieren von Krankheitserregern befallene Zellen mit ihren Nachbarn? Welche Transkripte, Proteine und Metaboliten werden in Massenanalysen maskiert, spielen aber bei Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Krankheitserregern eine wesentliche Rolle? Jüngste Fortschritte in der Einzelzell-/-kern- und räumlichen Analyse erleichtern die Untersuchung dieser grundlegenden Fragen9,10,11,20,21,22,23.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ermöglicht die Erstellung von Genexpressionsprofilen in einzelnen Zellen22,24,25,26. scRNA-seq wurde zunächst entwickelt, um das zelluläre Transkriptom eines einzelnen Maus-Blastomers zu analysieren27. Im Jahr 2012 wurde diese Technologie verwendet, um Hunderte von Zellen zu profilieren; Im Jahr 2015 wurde ein Transkriptionsprofil von 44.808 Mauszellen erstellt28,29. Im Jahr 2016 wurde scRNA-seq für Pflanzenwurzelgewebe eingeführt30. Seitdem wird diese Technologie verwendet, um die Pflanzenentwicklung und die Akklimatisierung an sich verändernde Umgebungen zu verstehen22,31,32.

Die am weitesten verbreitete scRNA-seq-Technologie ist tröpfchenbasiert und kombiniert Mikrofluidik mit Barcodes, um eine parallele Transkriptomprofilierung einzelner Zellen mit hohem Durchsatz zu ermöglichen (inDrop, Drop-seq und 10× Genomics; Abb. 1)22,25, 29. Eine Pflanzenzelle besteht aus Transkripten sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern. Die Halbwertszeit eines Transkripts kann bis zu 24h33 betragen. Daher kann das zelluläre Transkriptom die Genexpression im Laufe der Zeit erfassen. RNA-seq kann mit Kernen (snRNA-seq) oder isolierten einzelnen Zellen (scRNA-seq) durchgeführt werden. Bei Arabidopsis zeigten 14 % aller Gene eine unterschiedliche Expression zwischen diesen beiden Methoden34. snRNA-seq erkannte weniger Transkripte als scRNA-seq, erfasste aber dennoch etwa 90 % der gesamten in scRNA-seq erkannten Transkripte. Ein Vorteil von snRNA-seq besteht darin, dass dieser Ansatz die Profilierung von Zellen ermöglicht, die schwer enzymatisch zu verdauen sind. Insgesamt weisen sowohl snRNA-seq als auch scRNA-seq eine hohe Korrelation mit der Bulk-RNA-seq auf (r = 0,7–0,8) und spiegeln das Expressionsmuster in intaktem Gewebe wider34. Für snRNA-seq können Kerne mit verschiedenen Ansätzen aus frischem oder gefrorenem Gewebe isoliert werden35,36,37. Für scRNA-seq werden einzelne Zellen durch enzymatische Verdauung aus Pflanzengeweben isoliert (Abb. 1)22. Der Protoplastierungsprozess führt zu transkriptionellen Veränderungen, die sich auch zelltyp-/zustandsspezifisch auf Transkripte auswirken können38,39. Daher ist es wichtig, Massen-RNA-Seq des gesamten Gewebes als Kontrolle einzubeziehen, um Gene auszuschließen, die vom Protoplastierungsprozess betroffen sind. Als nächstes werden isolierte Zellen abgetrennt und mithilfe von Mikrofluidik in Tröpfchen mit Barcode-Kügelchen eingekapselt. Anschließend kommt es innerhalb der Tröpfchen zur Zelllyse und zur cDNA-Barcodierung. Schließlich werden Transkripte parallel auf der Illumina-Plattform sequenziert und demultiplext (Abb. 1)22,26.

Für scRNA-seq werden einzelne Zellen durch enzymatischen Verdau aus intaktem Gewebe isoliert, um Protoplasten zu erzeugen. Mikrofluidik wird verwendet, um einzelne Protoplasten mit Barcode-Perlen zu trennen und in Tröpfchen einzukapseln. Jede Perle mit Barcode ist mit DNA-Sonden beschichtet, die Poly (dT) zum Einfangen von mRNAs, einen eindeutigen molekularen Identifikator (UMI) und einen zellspezifischen Barcode enthalten. Dann kommt es zur Zelllyse, und mRNAs werden mit Sonden hybridisiert und auf Kügelchen in Tröpfchen revers transkribiert. Schließlich wird eine Bibliothek barcodierter cDNA aus Tausenden von Einzelzellen sequenziert, um Einzelzell-Transkriptome zu erzeugen. Für die räumliche Transkriptomik wird frisch gefrorenes Pflanzengewebe auf einem räumlichen Transkriptomik-Objektträger geschnitten. Die Aufnahmezonen auf der Folie enthalten Tausende von Punkten. Jeder Spot besteht aus Sonden, die einen eindeutigen räumlichen Barcode, einen eindeutigen molekularen Identifikator (UMI) und eine Poly(dT)-Region zur Erfassung von Transkripten enthalten. Transkripte werden durch Permeabilisierung freigesetzt, mit Sonden hybridisiert und revers transkribiert, um räumliche Barcodes zu integrieren. Die generierten cDNAs, die räumliche Informationen tragen, werden vom Objektträger abgespalten und zur Vorbereitung einer Bibliothek für die Sequenzierung verwendet. Die sequenzierten Lesevorgänge werden anhand räumlicher Barcodes räumlich kartiert. Erstellt mit BioRender.com.

Zusätzlich zu tröpfchenbasierten Methoden werden plattenbasierte Methoden typischerweise mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) kombiniert, um interessierende Zellen in einzelne Vertiefungen einer Platte zu sortieren22,24,25. FACS ist eine bewährte Methode, die in Verbindung mit fluoreszierenden Reporterlinien verwendet wird, um bestimmte Zellgruppen zu erfassen. Beispielsweise wurde FACS verwendet, um bestimmte Phloem- und Wurzelzelltypen zu sortieren, die dann von scRNA-seq40 analysiert wurden. Während plattenbasierte Methoden eine geringere Anzahl profilierter Zellen aufweisen, weisen sie die höchste Empfindlichkeit bei der Untersuchung seltener Transkripte oder begrenzter Gewebe auf22,24. Die Laser-Mikrodissektion ist eine weitere Methode, um Dutzende oder Hunderte von Zellen unter direkter mikroskopischer Visualisierung zu erfassen41. Jüngste Fortschritte bei kombinatorischen Barcoding-Strategien (SPLiT-seq und sci-RNA-seq) ermöglichen die transkriptomische Profilierung aus einer exponentiell skalierbaren Anzahl einzelner Zellen oder Kerne42,43,44.

Für die Isolierung einzelner Zellen ist eine Gewebedissoziation erforderlich, die jedoch zu Schäden und einem Verlust des räumlichen Inhalts innerhalb eines Gewebes führt, was für das Verständnis der Zellfunktion von entscheidender Bedeutung ist20. Die räumliche Transkriptomik (ST) wurde entwickelt, um räumliche Informationen zu bewahren und gleichzeitig die zelluläre Genexpression mit hoher Auflösung zu profilieren. ST umfasst punktbasierte und auf Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) basierende Methoden. Spotbasierte ST nutzt punktspezifische Barcodes, die in einem Array verankert sind, um mRNAs aus Gewebekryoschnitten zu erfassen und zu markieren (Abb. 1)21,45. Dies wurde kommerzialisiert und in menschlichen/tierischen Geweben mit Einzelzellauflösung angewendet46. Kürzlich wurde die punktbasierte ST auf Pflanzengewebe ausgeweitet, einschließlich Blattknospen von Populus tremula, Arabidopsis- und Picea abies-Zapfen9,21,37,47. Bei der räumlichen Transkriptomik-Technologie von Visium (10× Genomics) beträgt der Mittelpunkt-zu-Mitte-Abstand zwischen benachbarten Spots 100 µm, was größer ist als die durchschnittliche Größe einer einzelnen Pflanzenzelle (10–100 µm)21,45. Der größere Abstand zwischen den Punkten verringert die Auflösung für ein einzelnes Gewebestück, könnte aber letztendlich durch die Einbeziehung zusätzlicher Erfassungsbereiche ausgeglichen werden. Eine weitere punktbasierte ST-Technologie, Stereo-seq, wurde auf Arabidopsis-Blätter angewendet. Stereo-seq dockt einen Nanoball als Spot an, wodurch sich der Abstand zwischen benachbarten Spots deutlich auf 500 nm verringert47. Zusätzlich zu den punktuellen Methoden wurden die FISH-basierten ST in der Pflanzenforschung eingesetzt11,37. Beispielsweise wurde eine auf Pflanzenhybridisierung basierende gezielte Beobachtung der Genexpressionskarte (PHYTOMap) entwickelt, um die Expression von Dutzenden von Genen auf Einzelzellebene im gesamten Arabidopsis-Wurzelgewebe räumlich aufzulösen11. PHYTOMap ist kostengünstiger als kommerziell erhältliche räumliche Transkriptom-Plattformen wie Molecular Cartography (Resolve Biosciences) und MERSCOPE (Vizgen).

Transkriptomische Ansätze ermöglichen es Forschern, zelluläre Veränderungen indirekt zu analysieren, aber proteomische und metabolische Profilierung ermöglicht eine direktere Charakterisierung der funktionellen Leistung einer Zelle48. Fortschritte bei Einzelzell- und Raumtechnologien zur Charakterisierung proteomischer und metabolischer Zustände sind aufgrund technischer Herausforderungen nicht so weit fortgeschritten wie transkriptomische Analysen48,49,50. Zu den technischen Herausforderungen, die sich aus der Natur von Metaboliten und Proteinen ergeben, gehören: unterschiedliche chemische Zusammensetzungen, die für unterschiedliche Analyttypen erforderlich sind, unterschiedliche Proteine und Metaboliten mit unterschiedlicher Häufigkeit und die Fähigkeit von Metaboliten, aus Zellen auszutreten. Darüber hinaus ist die Nachweisgrenze für die Quantifizierung von Proteinen und Metaboliten häufig höher als für die Transkriptionsprofilierung, und die Identifizierung von Metaboliten hängt vom Vorhandensein einer Bibliothek bekannter Verbindungen ab51. Kürzlich wurden ortsaufgelöste Proteomanalysen mittels Laser-Capture-Mikrodissektion in Verbindung mit nanotröpfchenbasierter Probenahme verwendet, um Proteine aus ca. 8–15 Parenchymzellen des Fruchtperikarps der Tomatenfrucht zu profilieren, waren jedoch auf ca. 400 Proteine beschränkt52,53. Die räumliche Metabolomik hat die Profilierung eines einzelnen mit Bradyrhizobium japonicum inokulierten Sojabohnenwurzelknöllchens ermöglicht10. Massenspektrometrische Bildgebung kann die räumliche Verteilung und Quantifizierung gezielter Pflanzenmetaboliten mit einer Auflösung von bis zu Einzelzellen auflösen54,55.

Pflanzenpathogene nutzen vielfältige Invasionsstrategien und können unterschiedliche Gewebetypen besiedeln. Die meisten Forschungsarbeiten konzentrierten sich auf die Blattinvasion durch offene Stomata und Wunden oder durch direktes Eindringen in die Blattepidermis1,19. Allerdings können mehrere verheerende bakterielle, pilzliche und virale Krankheitserreger in das Gefäßgewebe eindringen2,3,56. Beispielsweise besiedeln bodenbürtige Krankheitserreger häufig das Xylem und müssen sich durch mehrere Zelltypen in der Wurzel bewegen, um das Gefäßsystem zu erreichen57. Wissenschaftler wissen immer noch nicht genau, welche Zelltypen von Krankheitserregern manipuliert werden und wie diese Zellen auf eine Infektion mit Krankheitserregern reagieren können.

Während Wurzeln für die Übertragung von Immunsignalen zuständig sind, reagieren verschiedene Zonen innerhalb der Wurzel unterschiedlich auf MAMPs oder eine Pathogeninfektion58,59,60,61,62. Unter Verwendung fluoreszierender Reporterlinien für Immunmarkergene und eines PRR-Rezeptors zeigen differenzierte äußere Zellschichten in der Arabidopsis-Wurzel eine gedämpfte MAMP-Empfindlichkeit, bis sie Schaden erfahren, was lokal die Immunreaktionsfähigkeit steigert16,17. Diese räumlich begrenzten Wurzelreaktionen können auf die Verbreitung mikrobieller Gemeinschaften in der Rhizosphäre zurückzuführen sein17. RNA-seq-Analysen zeigten auch, dass die NLR-Genexpression zwischen den Organen auf artspezifische Weise variiert63. Eine kürzlich durchgeführte Studie erstellte mithilfe von snRNA-seq37 einen Transkriptomatlas von Arabidopsis von Samen zu Samen, der alle wichtigen Organe umfasst. Diese wichtige Ressource kann zur Abfrage der Expression von PRRs, NLRs und Immunsignalnetzwerken verwendet werden, um einen besseren Einblick in die entwicklungs- und gewebespezifische Regulierung der Immunkompetenz zu gewinnen.

Die Möglichkeit, die Reaktion auf Krankheitserregerinfektionen mit räumlicher und zellulärer Auflösung zu profilieren, wird zu einem ganzheitlicheren Verständnis der Reaktion von Pflanzen auf verschiedene Krankheitserreger führen. Welche Zelltypen sind immunfähig? Wie verändert sich die zelluläre Signalübertragung je nach Zell- und Gewebetyp? Immunantworten können nicht vollständig verstanden werden, ohne die Rolle verschiedener Zelltypen, des Pflanzenalters und des Entwicklungsstadiums zu berücksichtigen. Wissenschaftler haben damit begonnen, mithilfe einer Kombination aus sc/snRNA-seq und FISH-basierter räumlicher Kartierung von Transkripten unterschiedliche Immunstatus in verschiedenen Zelltypen aufzudecken64,65. Beispielsweise zeigte ein erheblicher Teil der Toll/Interleukin-1-Rezeptor-NLR (TNL)-Gene eine verstärkte Expression im Gefäßsystem, während dies bei Coiled-Coiled-NLR (CNL) und CCR-Domänen-NLRs in Arabidopsis nach Inokulation mit dem Pilz nicht beobachtet wurde Erreger Colletotrichum higginsianum64. In Arabidopsis-Pflanzen, die mit virulenten und avirulenten P. syringae infiziert waren, wurden mithilfe einer Kombination aus snRNA-seq-, snATAC-seq- und räumlichen Transkriptomanalysen (MERFISH) auch deutliche Muster der Immungenexpression in bestimmten Zellpopulationen festgestellt65. Beispielsweise zeigten Gene, die an der systemischen erworbenen Resistenz (SAR) beteiligt sind, darunter ALD1, FMO1 und ILL6, auch eine verstärkte Expression in Phloem-Begleitzellen, was darauf hindeutet, dass dieser Zelltyp möglicherweise eine einzigartige Rolle bei der Regulierung von SAR spielt und zur Übertragung systemischer Immunsignale beiträgt65. Durch die Aufklärung zelltypspezifischer Immunantworten tragen diese Studien zu einem besseren Verständnis der Komplexität und Koordination pflanzlicher Immunantworten bei.

Genetisch kodierte fluoreszierende Reporterlinien, die Immunmarker in definierten Zelltypen exprimieren, wurden auch zur räumlichen Untersuchung von Pflanzenreaktionen verwendet16,17. Eine Kombination aus FACS- und SMART-seq-Einzelzelltechnologien ermöglichte die Transkriptionsprofilierung von Protophloem-Siebelementen, Metaphloem-Siebelementen, Begleitzellen und Phloempol-Pericycluszellen40. Ein ähnlicher Ansatz könnte die Untersuchung spezifischer Reaktionen seltener Zelltypen oder -zustände während einer Pathogeninfektion durch sc/snRNA-seq oder ST erleichtern (Abb. 2).

Ein schematisches Diagramm, das repräsentative Forschungsbereiche zeigt, die durch Einzelzell-, Einzelkern- und räumliche Profilierung untersucht werden können. Eine Kombination verschiedener Ansätze wird zu einem umfassenderen Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben führen. Erstellt mit BioRender.com.

Die mikrobielle Verteilung in und auf Pflanzengewebe ist unterschiedlich66,67. Darüber hinaus existieren innerhalb eines Gewebes auch unter kontrollierten Bedingungen mehrere Infektionsstadien gleichzeitig. Beispielsweise können in einer einzelnen Reisblattscheide nach der Inokulation mit dem Pilzpathogen Magnaporthe oryzae gleichzeitig drei verschiedene Infektionsphasen beobachtet werden (frühe und späte biotrophe, vorübergehende nekrotrophe Phase)4. Sporen des Pilzpathogens Zymoseptoria tritici keimen und dringen 10 Tage lang in Weizenblätter ein, was zu mehreren gleichzeitig auftretenden asynchronen Infektionen führt7,68,69. Die pflanzliche Reaktion auf asynchrone Infektionen und ungleichmäßiges Effektor-Targeting führt zu heterogenen zellulären Reaktionen, die mit Massen-RNA-Seq-Analysen nicht aufgedeckt werden können.

Die Verteilung von Krankheitserregern innerhalb eines Gewebes ist nicht nur unterschiedlich, sondern Krankheitserreger weisen während der Infektion auch Unterschiede in der Genexpression von Zelle zu Zelle auf70,71,72. Beispielsweise weist der nekrotrophe bakterielle Krankheitserreger Dickeya dadantii Heterogenität in der Zelllänge und Genexpression auf, um Virulenz und vegetatives Wachstum während der Infektion auszugleichen70. Bei Pseudomonas syringae zeigt die Expression der Gene, die das Typ-3-Sekretionssystem kodieren, ein reversibles bistabiles Expressionsmuster, das die bakterielle Virulenz beeinflusst72. Der Einfluss der Transkriptionsheterogenität in isogenen Bakterienpopulationen kann nicht mithilfe von Massen-RNA-Seq-Analysen untersucht werden. Technische Herausforderungen haben die Anpassung der scRNA-seq-Technologie an Mikroben behindert; prokaryotische mRNAs kommen in geringerer Menge vor und sind nicht polyadenyliert. Dennoch wurden kürzlich mehrere Tools für die RNA-Sequenzierung von Einzelzellbakterien in vitro entwickelt, darunter mikrobielle Split-Pool-Ligations-Transkriptomik (microSPLiT), sondenbasierte Bakteriensequenzierung (ProBac-seq) und prokaryotisches Expressionsprofil durch Markieren von RNA in situ und Sequenzierung (PETRI-seq)73,74,75. Die Kombination dieser Werkzeuge in Verbindung mit effizienten Methoden zur Bakterienisolierung aus Pflanzengewebe, wie etwa einer Dichtegradientenzentrifugation in Gegenwart eines RNA-Schutzreagens76, könnte dazu beitragen, heterogene mikrobielle Reaktionen während einer Infektion aufzuklären.

Das Verständnis des Zusammenhangs zwischen der mikrobiellen Verteilung und der räumlich-zeitlichen Regulierung von Pflanzenreaktionen während der Kolonisierung bleibt ein Bereich, der weiterer Forschung bedarf77. Die räumliche Verteilung komplexer Bakteriengemeinschaften im Pflanzengewebe wurde kürzlich mithilfe einer neuartigen Technik namens Sequential Error-Robust FISH (SEER-FISH)78 beschrieben. Cao et al.78 untersuchten die mikrobiellen Besiedlungsmuster entlang der Wurzel und beobachteten Veränderungen in den räumlichen Beziehungen zwischen verschiedenen mikrobiellen Taxa in synthetischen Gemeinschaften. In natürlichen Umgebungen interagieren Pflanzen mit verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften, die ein breites Spektrum an Verhaltensweisen zeigen, von pathogen bis wechselseitig79. Um die SEER-FISH-Methode auf natürliche Gemeinschaften anzuwenden, ist es notwendig, zunächst die Arten zu identifizieren, aus denen die Bakteriengemeinschaft besteht. Die kürzlich durchgeführte gleichzeitige Erkennung von mikrobiellen Standorten und Pflanzentranskripten mittels räumlicher Transkriptomik unterstreicht die Heterogenität sowohl der mikrobiellen Verteilung als auch der Pflanzenreaktionen innerhalb desselben Blattes9,65. Zukünftige Fortschritte in der ST sollten die Profilierung von Transkriptomen sowohl von Pflanzen als auch von Krankheitserregern ermöglichen, einschließlich der Profilierung von auf Krankheitserreger gerichteten und benachbarten Zellen (Abb. 2). Durch die Untersuchung der transkriptomischen Veränderungen, die sowohl in den Pflanzen- als auch in den Mikrobenzellen während der Kolonisierung auftreten, können Forscher ein umfassendes Verständnis der molekularen Wechselwirkungen und Signalprozesse gewinnen, die an der Etablierung von Pflanzen-Mikroben-Assoziationen beteiligt sind.

Mehrere neuere Studien haben die Bedeutung raumzeitlicher Pflanzenreaktionen unter Verwendung von ST, scRNA-seq allein oder einer Kombination aus scRNA-seq und genetisch kodierten Reporterlinien hervorgehoben36,64,65,80,81,82,83,84,85,86, 87. Verschiedene Zelltypen in Medicago truncatula-Wurzeln zeigten eine unterschiedlich regulierte Genexpression als Reaktion auf den bakteriellen Symbionten Ensifer (Sinorhizobium) meliloti36. Die Einzelzell-Metabolomik hat auch eine metabolische Heterogenität in Wurzelknöllchen gezeigt, die vom symbiotischen Bakterium Bradyrhizobium japonicum10 besiedelt sind. Die zelluläre Heterogenität bei Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben kann mithilfe von Zelltrajektorienanalysen zeitlich visualisiert werden80,81,82,83,87 (Abb. 2). Beispielsweise wurde durch die Einzelzell-Transkriptomanalyse einer kompatiblen Interaktion zwischen Arabidopsis und P. syringae ein Kontinuum des Krankheitsverlaufs von einem immun- zu einem anfälligen Zustand innerhalb eines Blattes aufgedeckt82. Darüber hinaus wird die zelluläre Heterogenität der pflanzlichen Immunantwort auch räumlich reguliert. Eine räumlich eingeschränkte Immungenexpression korreliert mit der Pathogenverteilung, wobei Pflanzenzellen in der Nähe der Pathogenbesiedlung eine stärkere Immungenexpression aufweisen9,64,65,82,88. P. syringae dringt durch natürliche Öffnungen wie Stomata in den Apoplasten der Pflanze ein und reichert sich in substomatalen Hohlräumen an. Zhu et al.82 fanden heraus, dass die Expression des Immunmarkers FRK1 in Zellen, die diese von P. syringae besiedelten Hohlräume umgeben, stark induziert wurde. Darüber hinaus beobachteten Liu et al.88 bei Arabidopsis zwei aufeinanderfolgende Spitzen transkriptomischer Reaktionen während der durch den AvrRpt2-Effektor induzierten ETI. Diese Peaks repräsentierten unterschiedliche Zellpopulationen mit unterschiedlichen Genexpressionsmustern. Der erste Peak entsprach Zellen, die zellautonom auf AvrRpt2 reagierten, was auf eine lokalisierte Immunantwort hinweist. Der zweite Peak bestand aus Zellen, die die ursprünglich reagierende Population umgaben, was auf eine koordinierte Reaktion in den benachbarten Zellen schließen lässt. Zukünftige Fortschritte unter Verwendung einer Kombination aus Einzelzell- und hochauflösenden räumlichen Ansätzen werden bessere Einblicke in die zelluläre Heterogenität und die raumzeitliche Dynamik bei Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben liefern.

Kennzeichen pflanzlicher Immunantworten (ROS-, Ca2+-, DAMP-Produktion) fungieren als wichtige Signalmoleküle für die Kommunikation von Zelle zu Zelle89. Die globale Neuprogrammierung von Pflanzengeweben zur Abwehr beeinträchtigt das Pflanzenwachstum90. Bei einer natürlichen Infektion müssen Pflanzen in der Lage sein, die Infektion mit Krankheitserregern einzudämmen, ohne das gesamte Gewebe vollständig neu zu programmieren. Pflanzen können Abwehrreaktionen kompartimentieren, indem sie Immunreaktionen innerhalb eines Blattes durch eine lokal erworbene Resistenz (LAR) räumlich auf einige Zellschichten beschränken91,92. Sowohl Transkriptionsreporterlinien als auch räumliche Transkriptomik haben bei ETI-Aktivierung räumlich begrenzte Immunantworten von Arabidopsis-Blättern um Bakterienkolonien herum gezeigt65,82,92,93,94,95. Darüber hinaus zeigten drei weitere Immunreporterlinien die Expression von Immuntranskripten in einem kreisförmigen Muster mehrerer Zellschichten in unmittelbarer Nähe zu P. syringae-Kolonien nach Oberflächeninokulation82. Die Expression pflanzlicher Abwehrgene und die Mikrobenhäufigkeit zeigen ebenfalls räumliche Korrelationen sowohl bei im Freien angebauten als auch bei in Wachstumskammern inokulierten Arabidopsispflanzen mit ST9,65.

Trotz erheblicher Fortschritte bei Einzelzelltechniken bleiben Herausforderungen bei der Untersuchung dynamischer Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehr Organismen bestehen. Beispielsweise bleibt die Identifizierung, Isolierung und Profilierung von Pflanzenzellen, in die Krankheitserreger eindringen, eine Herausforderung. Die physikalische Wechselwirkung zwischen Pflanzenzellen und dem Krankheitserreger wird nach der Isolierung der Zellkerne aufgehoben. Fortschritte bei ST und Strategien zur Markierung infizierter Zellen in direktem Kontakt mit dem Erreger sind erforderlich. Diese Fortschritte werden das Verständnis dafür erleichtern, wie von Krankheitserregern befallene Pflanzenzellen mit ihren Nachbarn kommunizieren. Es wird auch wichtig sein, die zelluläre Signalübertragung als Reaktion auf verschiedene Krankheitserreger in verschiedenen Infektionsstadien in verschiedenen Gewebetypen über Pflanzengenotypen hinweg zu profilieren, um ein ganzheitliches Verständnis des Repertoires zu erhalten, wie Pflanzen auf Krankheitserregerinfektionen reagieren.

Die gleichzeitige Transkriptionsprofilierung sowohl der Pflanze als auch des Krankheitserregers bleibt bei der zellulären Auflösung eine Herausforderung. Sowohl Pflanzen als auch Krankheitserreger zeigen Heterogenität in ihren Reaktionen. Die aktuelle Technologie erfasst polyadenylierte eukaryotische Transkripte zur Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung. Dieser Schritt hemmt das Einfangen der meisten bakteriellen und viralen Transkripte. Um Tausende von Zellen oder Zellkernen zu erfassen, wird in den meisten Studien Gewebe aus mehreren gepoolten Pflanzen gesammelt, wodurch die Variation von Pflanze zu Pflanze verdeckt wird. Weitere Herausforderungen sind Kosten, Datenanalyse und Integration96. Dies ähnelt den frühen Stadien der Transkriptionsprofilierung mithilfe von Microarrays und RNA-Seq. Die Entwicklung von Hochdurchsatzmethoden mit reduzierten Kosten für ST, Einzelzellen und snRNA-seq wird eine breitere Nutzung dieser Ansätze erleichtern.

Während der Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben haben Pflanzen eine fein regulierte Zell-zu-Zell-Kommunikation entwickelt, um der ständigen Belastung durch mikrobielle Herausforderungen entgegenzuwirken89. Die Einzelzellanalyse wurde verwendet, um die Zell-zu-Zell-Kommunikation in Pflanzenwurzelzellen auf Entwicklungs- und abiotische Signale hin zu untersuchen, jedoch noch nicht auf Pflanzen-Mikroben-Interaktionen97,98. Mit der Entwicklung räumlicher Techniken wird die räumlich aufgelöste Transkriptomik das Verständnis der Kommunikation von Zelle zu Zelle erleichtern9,65. Darüber hinaus kann die Einbeziehung räumlicher Koordinaten in eine Zelltrajektorie Unterschiede zu Daten auflösen, die aus dissoziierten Zellen generiert wurden.

Zukünftige Untersuchungen mit räumlichen Technologien mit Einzelzellauflösung werden ein umfassenderes Verständnis darüber ermöglichen, wie Pflanzenzellen mit ihren Nachbarn kommunizieren und robuste, aber räumlich begrenzte Abwehrreaktionen auslösen können. Die Identifizierung von Transkriptionsfaktoren und Transkripten, die in Massenanalysen maskiert werden, hat den Aufbau von Genregulationsnetzwerken (GRNs) mit Einzelzellauflösung ermöglicht36,39,81. Die nächste Grenze der Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben wird die Integration mehrerer Omic-Ansätze mit räumlicher und zellulärer Auflösung erfordern, einschließlich Transkriptom, Epigenom, Metabolom und Proteom65,99 (Abb. 2). Integrierte Analysen mit Einzelzell-Multi-Omics und räumlichen Omics bieten die Möglichkeit, zellspezifische Reaktionen ganzheitlich zu untersuchen und die Landschaft der Reaktionsfähigkeit von Pflanzen und Krankheitserregern mit räumlicher Auflösung aufzudecken22,65. Die aus solchen Analysen generierten Hypothesen können dann experimentell im Kontext verschiedener Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Krankheitserregern überprüft werden. Letztendlich wird ein hochauflösendes Verständnis darüber, wie Pflanzen auf verschiedene Krankheitserreger reagieren, neue Regulierungsmechanismen identifizieren, die für eine wirksamere Krankheitsbekämpfung genutzt werden können.

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Wir danken den Mitgliedern des Coaker Laboratory, Benjamin Cole und Tatsuya Nobori für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [Fördernummer R35GM136402] für GCAM-P unterstützt. wurde durch ein Postdoktorandenstipendium der Fundación Alfonso Martín Escudero unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jie Zhu, Alba Moreno-Pérez.

Abteilung für Pflanzenpathologie, University of California, Davis, One Shields Avenue, Davis, CA, 95616, USA

Jie Zhu, Alba Brown-Perez und Gitta Coaker

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Alle Autoren haben zum Verfassen des Manuskripts und den präsentierten Ideen beigetragen. GC leitete die Struktur und schloss das Schreiben ab. JZ generierte Abbildungen. 1 und 2.

Korrespondenz mit Gitta Coaker.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Andre Velasquez und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptherausgeber: Shahid Mukhtar, George Inglis.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhu, J., Moreno-Pérez, A. & Coaker, G. Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Pflanzenpathogenen mithilfe räumlicher und Einzelzelltechnologien. Commun Biol 6, 814 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05156-8

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Eingegangen: 07. April 2023

Angenommen: 18. Juli 2023

Veröffentlicht: 04. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05156-8

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